ルイージは豪華なホテルへの招待状を受け取り、マリオたちと夢のバケーションへと出発する。しかし、キング・ブウが、すべてはマリオたちを捕らえるための策略だったと明かすと、彼の夢はたちまち悪夢へと変わる。気乗りしない臆病な英雄ルイージは、再びE・ガッド博士の助けを借り、今や不気味なホテルの危険な階層を縦横無尽に駆け巡り、マリオたちを救う旅に出る。